これまでに数多くの重要なタンパク質結晶が研究者のたゆまぬ努力により晶出されてきた。しかしながら、タンパク質の結晶化には特殊な知識や高度な技能が要求されているわけでは決してない。大切なことは、精製された目的タンパク質を含む溶液の基本的性状に関する知識のみである。装置に依存しない合理的な計画に基づく着実な実験と観察の実践こそが、高品質なタンパク質結晶を得るための唯一の方法であると私は改めて感じている。
本書は、多くの研究者にタンパク質結晶について深く改めて考えて頂く良い機会になることを期待している。また執筆者はすべてこの分野で最先端の研究を展開されている方々ばかりである。そのため高度な内容を随所に含みながらも実用的な情報書になっていると自負している。本書を手にされた読者が、最前線の情報を目にすることで実験のヒントや研究の閃きに出会えることを願っている。
目次
【第I編 概論】
タンパク質結晶の新展開から最前線へ (高野和文)
1 はじめに
2 創晶プロジェクトが生んだもの
2.1 浮かべて撹拌して大型・高品質結晶を育成する
2.2 レーザーを照射して結晶を作る
2.3 レーザーで結晶を加工する
2.4 ゲル中で結晶を作る・レーザーで分子をゲル中に集積させ結晶を作る
3 創晶プロジェクトがもたらしたもの
3.1 結晶に特化したプロジェクトである
3.2 若手異分野連携バーチャルラボを運営する
3.3 結晶は皆同じ
3.4 タンパク質結晶を作るということ
4 これからの結晶づくりへの期待
【第II編 結晶化編】
第1章 試料の調製
1 試料作製技術 (喜多俊介、前仲勝実、福原秀雄)
1.1 組換え発現系
1.2 発現プラスミドの設計
1.2.1 融合タグ
1.2.2 可溶性発現,不溶性画分からの巻き戻し
1.2.3 共発現
1.2.4 分泌発現
1.2.5 膜タンパク質
1.3 大腸菌
1.3.1 概要
1.3.2 発現株
1.3.3 試料調製方法
1.4 酵母
1.4.1 概要
1.4.2 酵母の種類
1.4.3 試料調製方法
1.5 昆虫細胞
1.5.1 概要
1.5.2 細胞株,ウイルス株
1.5.3 試料調製方法
1.6 哺乳動物細胞
1.7 おわりに
2 無細胞タンパク質合成 (清水義宏)
2.1 はじめに
2.2 様々な種由来の無細胞タンパク質合成システム
2.3 無細胞タンパク質合成システムによるタンパク質試料の大量調製
2.4 目的のタンパク質試料に応じたタンパク質合成
2.4.1 分子内にジスルフィド結合を保持するタンパク質合成
2.4.2 膜タンパク質合成
2.4.3 天然には存在しないアミノ酸を含むタンパク質試料の調製
2.5 無細胞タンパク質合成システムを用いた進化工学による抗体分子の取得
3 動物細胞発現系を用いた細胞外タンパク質の試料調製 (禾晃和、三原恵美子、高木淳一)
3.1 はじめに
3.2 細胞外タンパク質の翻訳後修飾
3.3 糖鎖修飾系酵素変異株を用いた発現
3.4 安定発現株の構築
3.5 高密度培養装置を用いた発現
3.6 培養上清からのタンパク質精製
3.7 発現精製の具体例
3.8 今後の展望
4 タンパク質のリフォールディング (秋葉宏樹、津本浩平)
4.1 はじめに
4.2 タンパク質のフォールディング
4.3 抽出過程におけるフォールディング:リフォールディング
4.4 単離
4.5 可溶化
4.6 リフォールディング反応
4.7 小分子添加剤
4.8 L-アルギニン,NDSB,C12-グルタミン酸
4.9 おわりに
5 化学合成ペプチド•タンパク質の調製と結晶構造解析 (原利明)
5.1 化学合成ペプチド•タンパク質
5.2 化学合成ペプチドを用いる結晶構造解析
5.2.1 ペプチドの調達
5.2.2 構造解析例
5.3 2つのフラグメントを縮合するタンパク質化学合成
5.3.1 ネイティブケミカルライゲ—ション法
5.3.2 タンパク質フラグメントの調製
5.3.3 合成例と結晶構造解析
5.4 3つ以上のフラグメントを縮合するタンパク質化学合成
5.4.1 連続ライゲーション法
5.4.2 合成例と結晶構造解析
5.5 ラセミ体結晶化法
第2章 結晶化
1 小分子添加剤としてアミノ酸類を用いたタンパク質の結晶化 (山口宏)
1.1 はじめに
1.2 タンパク質結晶化のための溶液設計
1.3 アミノ酸類を添加したスパースマトリックス法による結晶化条件検索
1.4 アミノ酸類を第4成分として添加した時の結晶析出条件の拡張
1.5 リゾチームの硫酸アンモニウムを沈澱剤とした結晶化
1.6 アミノ酸類を沈澱剤として用いた結晶化
1.7 まとめ
2 凝固したアガロースゲル中での結晶化 (杉山成)
2.1 はじめに
2.2 アガロースゲル
2.2.1 アガロースの性質
2.2.2 アガロースのゼリー強度
2.2.3 タンパク質への影響
2.3 固相ゲル中結晶化
2.3.1 結晶化実験
2.3.2 レーザーによる結晶加工
2.3.3 X線回折データと結晶構造解析
2.4 固相ゲル中結晶化技術の特徴
2.4.1 結晶発生確率の上昇
2.4.2 乾燥耐性
2.4.3 浸透圧耐性
2.4.4 機械的強度の増加
2.4.5 ゲル繊維の取り込み
2.5 まとめと将来展望
3 微小体積タンパク質溶液の高圧下での結晶化 (吉川洋史)
3.1 はじめに
3.2 微小体積タンパク質溶液用の圧力セルの開発
3.3 膜タンパク質の結晶化への応用
3.4 おわりに
第3章 特殊環境下での結晶化
1 溶液流れ下でのタンパク質結晶育成技術 (丸山美帆子)
1.1 はじめに
1.2 タンパク質結晶育成のための溶液撹拌技術
1.3 TSSG-FAST法によって育成された結晶
1.4 溶液撹拌による結晶成長促進のメカニズム
1.5 おわりに
2 微小重力場を利用した結晶化 (中野博明、渡部邦彦)
2.1 はじめに
2.2 宇宙環境における結晶化実験の歴史
2.3 宇宙環境における結晶化実験の概要
2.4 宇宙環境における結晶化実験の実際
2.5 宇宙環境における結晶化実験の具体例
2.5.1 PzペプチダーゼBの場合
2.5.2 アミノペプチダーゼ(AM1AP)の場合
2.6 おわりに
第4章 膜タンパク質の結晶化
1 膜タンパク質のバイセルによる結晶化 (松森信明)
1.1 序
1.2 バイセル
1.3 実験法
1.4 応用例
1.5 結論
2 脂質メソフェーズ法による膜タンパク質の結晶化 (村上聡)
2.1 はじめに 〜膜タンパク質の取り扱いの難しさ
2.2 脂質環境への回帰
2.3 実験手法
2.3.1 遠心tubeによる混合
2.3.2 Two syringe法による混合
2.4 マトリクス脂質の相図
2.5 脂質メソフェーズ法による結晶化実験の実際
2.6 結晶の回収,クライオ処理と回折強度測定に関して
3 抗体を用いた膜タンパク質の結晶化 (名倉淑子、小笠原諭、田辺幹雄)
3.1 はじめに
3.2 膜タンパク質の構造生物学の現状と,抗体との共結晶の有効性
3.2.1 膜タンパク質の構造解析の問題点
3.2.2 抗体を使用するアドバンテージ
3.3 抗体の作製法,スクリーニング法
3.3.1 免疫・スクリーニングに使用する抗原膜タンパク質の状態
3.3.2 抗体作製
3.3.3 結晶化抗体のスクリーニング
3.3.4 結晶化抗体作製の留意点
3.4 膜タンパク質/抗体複合体の結晶化について
3.5 抗体との共結晶化の今後の展望
第5章 結晶の評価
1 タンパク質結晶のX線トポグラフィ (橘勝、小島謙一)
1.1 はじめに
1.2 X線トポグラフィ
1.3 タンパク質結晶の欠陥像の観測条件
1.4 ニワトリ卵白リゾチーム結晶の転位の観察
1.4.1 放射光白色トポグラフィ
1.4.2 放射光単色トポグラフィ
1.4.3 放射光デジタルトポグラフィ
1.5 まとめと今後の展望
2 OCTによる結晶の三次元イメージング (西澤典彦、松村浩由)
2.1 はじめに
2.2 OCT
2.3 超高分解能OCT装置(UHR-OCT)の構成
2.4 超高分解能OCTによるタンパク質結晶の観察
2.5 展望
3 タンパク質結晶成長の“その場”観察 (塚本勝男)
3.1 はじめに
3.2 結晶成長の“その場”観察
3.2.1 濃度分布
3.2.2 結晶表面
3.3 結晶表面の観察法
3.3.1 光学顕微鏡法
3.3.2 光干渉法
3.4 タンパク質結晶成長への応用例
3.4.1 成長速度・核形成速度
3.4.2 微細欠陥と結晶成長メカニズム
【第III編 構造解析編】
第1章 結晶の取扱いとマウント技術
1 クリスタルキャッチャーの開発 (高野和文)
1.1 はじめに
1.2 クリスタルキャッチャーの構造
1.3 粘着剤
1.4 結晶の接着
1.5 回折データ
1.6 おわりに
2 HAG法:水溶性ポリマーによるコーティングと湿度調整を用いたマウント法 (馬場清喜、熊坂崇)
2.1 はじめに
2.2 実験方法
2.2.1 コーティング剤
2.2.2 湿度調整装置
2.2.3 実験手順
2.3 コーティングの効果〜脆弱な試料を安定に保持
2.4 調湿の効果〜結晶構造変化の誘導
2.5 可塑剤の利用〜コーティング剤の変質とその防止
2.6 今後の展開
3 Fine-needleキャピラリーを用いたマウント法 (水野伸宏、熊坂崇)
3.1 はじめに
3.2 Fine-needle キャピラリーの作製
3.3 結晶操作
3.4 試料凍結と回折実験
3.5 希ガス誘導体結晶の調製
3.6 今後の展開
第2章 構造解析
1 XFEL微結晶構造解析-構造生物学の新時代 (溝端栄一、鈴木守、南後恵理子、田中里枝、井上豪、岩田想)
1.1 はじめに
1.2 XFELの特徴
1.3 微結晶の作製方法
1.4 リキッド・インジェクターの種類
1.5 データ処理の実際
1.6 おわりに
2 多剤輸送体MATEのX線結晶構造解析とペプチド創薬 (濡木理)
2.1 はじめに
2.2 特殊ペプチドの探索と共結晶化の意義
2.3 発現と構造決定
2.4 全体構造および既知構造との比較
2.5 薬剤結合ポケット
2.6 プロトンに駆動された薬剤の排出機構
2.7 環状ペプチドによる輸送阻害機構
2.8 おわりに
3 中性子構造解析の現状 (玉田太郎)
3.1 はじめに
3.2 なぜ中性子か?
3.3 中性子構造解析の実際
3.3.1 大型結晶の作製
3.3.2 試料の重水素化
3.3.3 中性子回折実験
3.3.4 中性子/X線の両回折データを用いた構造精密化
3.3.5 構造解析例
3.4 中性子構造解析の今後
3.5 おわりに
【第IV編 結晶構造の実用編】
第1章 医薬品設計のためのX線構造解析 (井上豪)
1 はじめに
2 X線構造解析の原理
3 低分子阻害薬の開発におけるX線構造解析の活用
4 抗体医薬品開発におけるX線構造解析の活用
第2章 高感度ATX/ENPP2活性検出蛍光プローブを用いたATX阻害剤の開発 (川口充康、長野哲雄)
1 はじめに
2 Autotaxin (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 2: ENPP2) とは
3 高感度なATX蛍光プローブTG-mTMPの開発
4 ATX阻害剤スクリーニング
5 ヒット化合物とATXの共結晶構造解析
6 化合物の構造最適化
7 最適化した化合物の生体への応用
8 おわりに
第3章 タンパク質結晶解析を基に水分子を考慮した分子設計 新規ヌクレオシド系抗悪性腫瘍薬の開発 (多田幸雄)
1 はじめに
2 新規ヌクレオシド系抗悪性腫瘍剤の開発コンセプト
3 TPの構造に基づくTPI分子設計の考え方
4 Uracilの5位置換基の最適化と6位置換モデル化合物
5 Hansch-Fujita 法(Classical QSAR)を用いたリード化合物(10)の最適化
6 阻害活性の向上に伴う血中濃度の低下に対するドラッグデザイン
7 X線結晶構造解析によるHTPの活性構造と阻害機構の検証
8 おわりに
第4章 経験的水和分布関数の構築とタンパク質水和構造予測への応用 (松岳大輔、中迫雅由)
1 はじめに
2 経験的水分子分布関数の構築
2.1 極性原子周辺の水和水分子分布
2.2 水和水分子の水素結合形態
3 経験的水分子分布関数を利用したタンパク質水和構造予測
4 おわりに
第5章 RNAアプタマーの立体構造と創薬 (野村祐介、坂本泰一)
1 はじめに
2 RNAアプタマーとは
2.1 SELEX法によるアプタマーの取得
2.2 RNAアプタマーの特徴
3 RNAアプタマーの構造と機能
3.1 RNAアプタマーとタンパク質の複合体
3.2 ヒトIgG1 Fcドメインに対するRNAアプタマー
3.3 ヒトIgG1 Fcドメイン-RNAアプタマー複合体
4 立体構造情報を用いたRNAアプタマーの改良
5 RNAアプタマーの実用化
第6章 3D印刷技術を用いた分子模型の作製 (川上勝)
1 はじめに
2 立体構造の把握をCGに頼る危険性とその限界
3 「模型」と構造生物学
4 タンパク質分子模型と3D造型技術
5 代表的なタンパク質分子模型例
6 新しい分子模型の提案1:透明で柔らかな分子模型
7 新しい分子模型の提案2:安価なFDM型3Dプリンターを用いた分子模型
8 分子模型がもたらす構造生命科学の進展の可能性
【第V編 総合編】
タンパク質結晶の設計を目指した要素技術開発 (菅原道泰、国島直樹)
1 はじめに
2 ゼオライトによるタンパク質結晶化制御
3 変異導入によるタンパク質結晶改善
4 結晶操作ツール
5 おわりに
【第VI編 付録 企業】
第1章 カイコ-バキュロウイルス発現系を用いた迅速かつ効率的な結晶構造解析用タンパク質生産技術 (仁田雅弘)
1 摘要
2 はじめに
3 カイコ-バキュロウイルス発現系の優位性
3.1 カイコ-バキュロウイルス発現系について
3.2 ProCubeによるカイコ-バキュロウイルス発現系の特長
3.3 発現実績
4 カイコ-バキュロウイルス発現系を用いた迅速かつ効率的な条件検討
4.1 コンストラクション検討の有用性
4.2 迅速なスケールアップ対応
5 おわりに
第2章 キナーゼ結晶構造情報を活用したドラッグデザイン (三宅隆弘、澤匡明)
1 はじめに
2 選択性向上を目指したキナーゼ-阻害剤複合体構造情報の活用
2.1 キナーゼ毎に違う結合様式
2.2 構造変化を誘導する化合物を結晶構造から見出す
2.3 キナーゼ立体構造の違いを巧みに利用したリガンドデザイン
3 おわりに
第3章 株式会社創晶(結晶化受託サービスと結晶化関連ツール) (安達宏昭)
1 はじめに
2 結晶化受託サービス
3 結晶輸送サービス
4 結晶化関連ツール
5 おわりに
